腎透明細胞癌(Clear cell renal carcinoma, ccRCC)是一種異質(zhì)性疾病,盡管原發(fā)病灶可以通過(guò)手術(shù)治療,但約40%會(huì )復發(fā)并發(fā)展為轉移癌,且5年生存率為10%【1】。盡管ccRCC是一種免疫原性腫瘤,但其調節有效抗腫瘤反應的腫瘤免疫細胞動(dòng)力學(xué)尚不完全清楚。迄今為止,對原發(fā)性ccRCC腫瘤微環(huán)境(TME)最全面的研究是通過(guò)飛行時(shí)間流式細胞術(shù)來(lái)檢測固有和適應性免疫標記物【2】,提出T細胞衰竭標志物的表達和CD38+髓細胞浸潤與更差的預后相關(guān)。近些年發(fā)展起來(lái)的scRNA-seq已經(jīng)成為一種有價(jià)值的工具,然而,還沒(méi)有靶向ccRCC的系統性的單細胞研究。需要注意的是,scRNA-seq的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)限制是基因表達譜非常稀疏,每個(gè)細胞中有80%-90%的基因可能未被檢測到,這一現象被稱(chēng)為“gene dropout”。因此,需要一種方法來(lái)解決某些重要特征可能被遺漏的問(wèn)題。

2021年5月20日,來(lái)自美國哥倫比亞大學(xué)歐文醫學(xué)中心的Charles G. Drake團隊在Cell雜志上發(fā)表了一篇題為Single-cell protein activity analysis identifies recurrence-associated renal tumor macrophages 的文章,這項研究通過(guò)對未經(jīng)治療的ccRCC切除的腫瘤和腫瘤周?chē)M織進(jìn)行了scRNA-seq,利用VIPER算法來(lái)定量單細胞蛋白的活性,發(fā)現了一個(gè)腫瘤特異性的TREM2/APOE/C1Q上調的巨噬細胞亞群,且在一個(gè)大型臨床驗證隊列中,這些標記物在手術(shù)后復發(fā)患者的腫瘤中顯著(zhù)富集。因此,這項研究確定的TREM2/APOE/C1Q陽(yáng)性巨噬細胞浸潤是ccRCC復發(fā)的潛在預后生物標志物,也可以作為一個(gè)候選治療靶點(diǎn)。

首先,作者從11個(gè)未經(jīng)治療的切除腫瘤及鄰近正常組織中分離出活細胞進(jìn)行scRNA-seq,在UMAP降維后可視化,并使用Seurat-Louvain算法進(jìn)行聚類(lèi)【3】,隨后使用VIPER進(jìn)行基于蛋白質(zhì)活性的聚類(lèi),并通過(guò)高參數光譜流式細胞儀對VIPER結果進(jìn)行了全面驗證。通過(guò)整合轉錄組學(xué)和基于VIPER的蛋白質(zhì)組學(xué)數據,作者描述了不同亞群、關(guān)鍵調節蛋白和候選配體/受體介導的相互作用,揭示了一種在所有腫瘤樣本中均被一致檢測到的新的腫瘤特異性巨噬細胞亞群(差異活性蛋白即LILRB5、APOE和TREM2;差異表達基因C1QA-C、APOE和TREM2)。

接下來(lái),作者通過(guò)免疫熒光染色來(lái)驗證與不良預后相關(guān)的巨噬細胞群體標記物是否在細胞中共同表達,并分析其空間定位以確定這些標記物是腫瘤、T細胞還是巨噬細胞相關(guān),尤其關(guān)注C1Q、APOE和TREM2這些與臨床結果密切相關(guān)的蛋白活性標記物。在所有樣本中,C1Q和TREM2都強烈富集于巨噬細胞中,尤其是C1Q+巨噬細胞與疾病復發(fā)顯著(zhù)相關(guān),也就是說(shuō)可以通過(guò)IF評估腫瘤內C1Q+巨噬細胞密度可為復發(fā)提供有用的預后生物標志物。此外,GSEA分析定義的疾病復發(fā)Kaplan-Meier曲線(xiàn),并獨立支持腫瘤浸潤巨噬細胞密度與術(shù)后復發(fā)的關(guān)聯(lián),突出了IF染色和scRNA-seq分析之間的強一致性。

總的來(lái)說(shuō),這篇文章報道了一個(gè)新穎且可以推廣的scRNA-seq分析流水線(xiàn)的開(kāi)發(fā)和應用,通過(guò)VIPER蛋白質(zhì)活性分析的補充,進(jìn)而能夠全面剖析TME中亞群的組成部分,揭示了這種富含于ccRCC的C1Q+TREM2+APOE+巨噬細胞群。其中,C1Q+巨噬細胞亞群的腫瘤浸潤與疾病復發(fā)之間存在著(zhù)顯著(zhù)的相關(guān)性,因此或許可以作為輔助治療的合適候選。盡管使用這種方法仍可能遺漏20-30%的差異活性蛋白質(zhì),相較于scRNA-seq中的80-90%遺漏率已經(jīng)有很大優(yōu)勢,未來(lái)可以在這一流水線(xiàn)的基礎上進(jìn)行改進(jìn)以將特征丟失降到最低。